癌症研究人员应用3D细胞培养的5大原因
- 作者: 基尔比生物科技
- 来源: 公众号“基尔比”
- 日期 : 2024-02-17
许多癌症模型系统可用于研究疾病发生机制和筛选治疗方法。不同的模型各有利弊，二维（2D）组织培养模型不能体现人体癌症组织的复杂性，而动物模型昂贵、耗时且经常不能反映人类肿瘤生物学。癌细胞的三维（3D）培养是发现新候选药物一种科学严谨的方法，可以加快新药发现速度，用于临床前筛查和测试，节省大量成本和时间。
临床前癌症药物研究中仅有 5% 的候选化合物通过了 III 期临床安全性和有效性试验。研究人员设计了大量的模型系统来研究肿瘤的复杂成分（图1）及其治疗方法，所有模型都有两个关键要求：首先是能够监控细胞数量和生存能力，因为癌症的一个关键特征是由多种机制维持的不受控制的细胞增殖；其次是研究癌细胞向周围组织迁移和侵袭的能力，因为癌细胞转移会损伤周围组织，使治疗复杂化。理想的模型可以包括血管生成和免疫系统逃避机制，因这两者都有助于肿瘤长期存活。同时临床前模型应相对便宜，适合高通量筛选，并尽可能地反映人类肿瘤生物学。
1. 3D培养细胞改变增殖速率和细胞形态
当癌细胞生长成扁平单层时，它们在整个表面以相对均匀的速度增殖。然而，相同的细胞在3D中生长会诱导不同速率的增殖区域（图 3），细胞分裂在球体外部发生得更快。
与单层生长的相同细胞相比，生长成 3D 球体的细胞对化疗的耐药性增加。这可能是因为球体内部的细胞受到球体外部细胞的药物渗透保护作用。也有人提出与上述差异增殖区有关的机制：一些化疗药物（如顺铂）可能通过在增殖细胞中诱导 DNA 损伤引起细胞凋亡，而封闭在球体内部的静止细胞则受到保护而不受顺铂等药物的影响，一旦外部细胞死亡，就会重新进入细胞周期，如果治疗过早停止，这些“受保护”的细胞可能会重现一个缩小但没有完全杀死的肿瘤。
3. 3D培养细胞具有表型异质性
同一肿瘤内的细胞群也会出现以不同增殖速率、基因表达和分化为标志的异质性，导致细胞形态和功能的改变。不同的表型意味着巨大的生理学差异，使得靶向药物难以杀死整个肿瘤。由于肿瘤不同区域有不同的氧气和营养浓度梯度，因此3D细胞培养模型比小鼠异种移植模型能更真实地模拟肿瘤。
4.3D培养细胞改变基因表达和细胞行为
同样的细胞在3D与2D中培养产生不同的基因表达模式。细胞外基质（ECM）控制细胞内信号的一个假设是通过跨膜整合素蛋白的不同亚型的结合。然后整合素与各种细胞内衔接蛋白相互作用形成粘着复合物，调节生长因子受体下游的信号通路（图 5）。在3D培养模型中，细胞与ECM和基质细胞的相互作用改变了细胞内信号转导，最终激活特定的转录因子。由于转录因子最终负责基因表达，细胞间相互作用的改变直接导致基因表达的改变。这些基因表达的改变驱动了形态学、增殖率和耐药性的改变，所有这些改变都促进了更具代表性的癌症组织的形成。
如上所述， 3D 培养细胞更接近于在活肿瘤内生长的细胞。建立 3D 模型系统可以通过更早地生成更真实的结果来节省时间和金钱。在体外重塑肿瘤要求包含肿瘤的所有成分，以重现典型的细胞形态和功能。这些成分中的每一个都会影响其他成分的生物学行为，并最终形成功能性肿瘤模型。当细胞从肿瘤中移除并在塑料平皿上单层生长时，这些相互作用的丧失改变了它们的生物学行为，并导致了不合标准的模型。在临床试验之前，通常需要在动物模型中评估疗效和毒性，但动物模型和人类生理学之间的物种差异导致无法建立符合人体的肿瘤微环境。而早期利用 3D培养细胞进行临床前研究可以极大提高对癌症的机制理解，筛除较差的候选药物，并有希望揭示在2D筛查中可能遗漏的新靶点。
临床前癌症药物研究中仅有 5% 的候选化合物通过了 III 期临床安全性和有效性试验。研究人员设计了大量的模型系统来研究肿瘤的复杂成分（图1）及其治疗方法，所有模型都有两个关键要求：首先是能够监控细胞数量和生存能力，因为癌症的一个关键特征是由多种机制维持的不受控制的细胞增殖；其次是研究癌细胞向周围组织迁移和侵袭的能力，因为癌细胞转移会损伤周围组织，使治疗复杂化。理想的模型可以包括血管生成和免疫系统逃避机制，因这两者都有助于肿瘤长期存活。同时临床前模型应相对便宜，适合高通量筛选，并尽可能地反映人类肿瘤生物学。
图1 上皮肿瘤和周围环境——一个复杂的生物学模型
动物模型常被用来研究人类肿瘤。癌症动物模型是在啮齿动物中通过手术植入肿瘤细胞或开发基因工程动物来建立，这些动物响应实验性改变的基因表达而自发地发展出类似人类的肿瘤（图 2）。
图2 啮齿动物癌症模型
最简单的癌症模型是利用源自人和动物肿瘤的细胞在培养基中进行单层培养。在这种结构中，细胞粘附在人造塑料或玻璃基板上，仅在其外围与其他细胞接触，不存在氧气、营养物或代谢废物的浓度梯度，无法反映体内的多细胞微环境。虽然在 2D 培养中生长的永生化肿瘤细胞系为癌症的发生机制提供了大量信息，但 95% 的药物研发失败率证明它是一个糟糕的药物研发模型。动物模型失败的原因尚不完全清楚。科学家们一直在研发3D组织培养模型，以弥合用于发现和筛选药物的体外实验与用于有效性和安全性评估的体内实验之间的差距。具有特定微环境的3D细胞培养模型与2D细胞培养及早期动物模型相比具有以下优势。1. 3D培养细胞改变增殖速率和细胞形态
当癌细胞生长成扁平单层时，它们在整个表面以相对均匀的速度增殖。然而，相同的细胞在3D中生长会诱导不同速率的增殖区域（图 3），细胞分裂在球体外部发生得更快。
图3球状体中氧、营养和代谢废物浓度不同的区域的细胞增殖
在3D中生长的卵巢上皮肿瘤细胞，会发生组织形态学分化，与分化良好的（I级）浆液性卵巢癌相似（图4）。相同的卵巢上皮肿瘤细胞在 2D 中生长时，则没有这种组织学分化。因此，3D培养可用于研究肿瘤形态。
图42D和3D中生长的卵巢上皮肿瘤细胞
2. 3D培养细胞揭示了更真实的药物反应与单层生长的相同细胞相比，生长成 3D 球体的细胞对化疗的耐药性增加。这可能是因为球体内部的细胞受到球体外部细胞的药物渗透保护作用。也有人提出与上述差异增殖区有关的机制：一些化疗药物（如顺铂）可能通过在增殖细胞中诱导 DNA 损伤引起细胞凋亡，而封闭在球体内部的静止细胞则受到保护而不受顺铂等药物的影响，一旦外部细胞死亡，就会重新进入细胞周期，如果治疗过早停止，这些“受保护”的细胞可能会重现一个缩小但没有完全杀死的肿瘤。
3. 3D培养细胞具有表型异质性
同一肿瘤内的细胞群也会出现以不同增殖速率、基因表达和分化为标志的异质性，导致细胞形态和功能的改变。不同的表型意味着巨大的生理学差异，使得靶向药物难以杀死整个肿瘤。由于肿瘤不同区域有不同的氧气和营养浓度梯度，因此3D细胞培养模型比小鼠异种移植模型能更真实地模拟肿瘤。
4.3D培养细胞改变基因表达和细胞行为
同样的细胞在3D与2D中培养产生不同的基因表达模式。细胞外基质（ECM）控制细胞内信号的一个假设是通过跨膜整合素蛋白的不同亚型的结合。然后整合素与各种细胞内衔接蛋白相互作用形成粘着复合物，调节生长因子受体下游的信号通路（图 5）。在3D培养模型中，细胞与ECM和基质细胞的相互作用改变了细胞内信号转导，最终激活特定的转录因子。由于转录因子最终负责基因表达，细胞间相互作用的改变直接导致基因表达的改变。这些基因表达的改变驱动了形态学、增殖率和耐药性的改变，所有这些改变都促进了更具代表性的癌症组织的形成。
图5 ECM控制细胞内信号转导来调节下游的信号通路
5. 3D培养细胞模拟肿瘤微环境如上所述， 3D 培养细胞更接近于在活肿瘤内生长的细胞。建立 3D 模型系统可以通过更早地生成更真实的结果来节省时间和金钱。在体外重塑肿瘤要求包含肿瘤的所有成分，以重现典型的细胞形态和功能。这些成分中的每一个都会影响其他成分的生物学行为，并最终形成功能性肿瘤模型。当细胞从肿瘤中移除并在塑料平皿上单层生长时，这些相互作用的丧失改变了它们的生物学行为，并导致了不合标准的模型。在临床试验之前，通常需要在动物模型中评估疗效和毒性，但动物模型和人类生理学之间的物种差异导致无法建立符合人体的肿瘤微环境。而早期利用 3D培养细胞进行临床前研究可以极大提高对癌症的机制理解，筛除较差的候选药物，并有希望揭示在2D筛查中可能遗漏的新靶点。